第二章　食品微生物基礎(chǔ)影響食品微生物生長的因素微生物的不同狀態(tài)亞致死細(xì)胞不可生長的活性微生物孢子及其重要性食品微生物生態(tài)學(xué)食品微生物的檢測及計(jì)數(shù)方法微生物指示菌類和微生物標(biāo)準(zhǔn),第一節(jié)影響食品微生物生長的因素影響微生物生長的內(nèi)在因素影響微生物生長的外在因素柵欄技術(shù),1.影響微生物生長的內(nèi)在因素pH水分活度氧化還原電位營養(yǎng)成分抗微生物成分生物結(jié)構(gòu),1)pH值pH值抑(殺)菌機(jī)制?WhysomeacidophilesshowinduciblepHHomeostasisandtheAcidToleranceResponse,anddowellinlowpHenvironments?pH動(dòng)態(tài)平衡和酸耐受性反應(yīng),①pH與微生物生長與發(fā)酵②pH與食品③pH抑菌/殺菌機(jī)理④pH動(dòng)態(tài)平衡與耐酸響應(yīng),微生物的最低、最適和最高pH微生物最低最高最適大腸桿菌4.39.56.0-8.0枯草芽孢桿菌4.58.56.0-7.5酵母2.58.04.0-5.8霉菌1.57.0-11.03.8-6.0最低pH與酸的種類有關(guān)，在相同pH值，有機(jī)酸較無機(jī)酸對微生物之抑制效果更強(qiáng)。細(xì)菌、放線菌：適于中性或偏堿的環(huán)境酵母、霉菌：適宜偏酸的環(huán)境,Variousshapesofμg–pHcurvesSpecificgrowthrateofbacteriaasafunctionofpHtoshowthevariousshapesofμg–pHcurves.pH對微生物生長的影響模型：一種熱力學(xué)統(tǒng)計(jì)方法BIOTECHNOLOGYANDBIOENGINEERING,59(6),1998,微生物生長最適pH與產(chǎn)物形成最適pH相互關(guān)系I型發(fā)酵較易控制II、III型發(fā)酵pH須嚴(yán)格控制IV型應(yīng)分別嚴(yán)格控制各自的最適pHQpμQpμQpμμQpIIIIIIVI,pH對微生物生長代謝的影響黑曲霉2-2.5利于產(chǎn)檸檬酸2.5-6.5以菌體生長為主7左右以合成草酸為主丙酮丁酸梭菌6.5-7.0以菌體生長為主6.3-6.5進(jìn)行丙酮丁酸發(fā)酵,①pH與微生物生長與發(fā)酵②pH與食品③pH抑菌/殺菌機(jī)理④pH動(dòng)態(tài)平衡與耐酸響應(yīng),各類食品的pH值非酸性食品(pH＞4.5)酸性食品(pH＜4.5)肉類：6.1-7.0牛乳：6.5-6.7蔬菜：6.0-6.8(茄子4.5)水果：柿子6.7蘋果2.9-3.3西瓜6.2-6.6葡萄3.4-4.5香蕉4.5-6.7檸檬1.8-2.0桔子3.6-6.3Notethatafood'sacidoralkaline-formingtendencyinthebodyhasnothingtodowiththeactualpHofthefooditself.,AlkalineFoods-AcidicFoodsIfafoodtendstoincreasetheacidityofurineafteritisingested,itisclassifiedasanacidformingfood.Conversely,ifafoodincreasesthealkalinityofurineafterithasbeeningested,itwasclassifieditasanalkalineformingfood.Forexample,orangejuiceisahighlyacidicfoodduetoitshighcitrusacidcontent,butafterbeingmetabolizeditwillcauseurinetobecomealkaline.,HowAlkalineFoodsandpHBalanceAffectYourHealthThehumanbodywasactuallyintendedtoruninaslightlyalkalinestate(7.35-7.45). TheoptimalsalivarypHforsalivais6.4to6.8.WeneedtoeatalkalinefoodstohelprestoretheproperpHbalance.(proteins,cereals,sugars).,微生物生長對食品基質(zhì)pH的影響發(fā)酵過程中pH調(diào)節(jié)分階段發(fā)酵,①pH與微生物生長與發(fā)酵②pH與食品③pH抑菌/殺菌機(jī)理④pH動(dòng)態(tài)平衡與耐酸響應(yīng),抑(殺)菌機(jī)制改變膜電位，影響膜的功能影響代謝過程中酶的活性影響基質(zhì)中各類物質(zhì)的性質(zhì)低pH可使蛋白質(zhì)變性或菌體表面蛋白質(zhì)和核酸水解,堿對微生物的作用堿類消毒劑5%-10%石灰乳，2%-3%NaOH消毒對象：環(huán)境、工具、設(shè)備和冷卻池等原理強(qiáng)堿能水解蛋白質(zhì)和核酸，使微生物的酶系和細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞分解菌體中的糖類，引進(jìn)細(xì)胞死亡抵抗力：芽孢菌＞G＋＞G－,酸對微生物的作用酸類食品防腐劑乳酸、醋酸、檸檬酸（風(fēng)味劑）、安息香酸、水楊酸乳酸菌發(fā)酵食品、酸漬食品、外加原理：增加H＋濃度，引起菌體表面蛋白(含酶類)變性和核酸水解苯甲酸和水楊酸可與微生物細(xì)胞中的成分發(fā)生氧化作用，從而抑制微生物的生長影響因素H＋濃度、游離陰離子和未電離的分子本身(有機(jī)酸)?溫度不同有機(jī)酸的殺菌效果不同,RelationshipsbetweenpHandproportionofundissociatedmoleculesofdifferentacids,ExternalconcentrationoforganicacidanionsandpH:keyindependentvariablesforstudyinghoworganicacidsinhibitgrowthofbacteriainmildlyacidicfoodsJFoodSci.2009;74(1):R12-5.,Transmembranepathwaysofundissociatedacidmoleculesanddissociatedprotons/anionsinabacterialcellatacidicandneutralpHlevelsBecause[A-]havetobeactivelypumped,theenergyofthecellisalmostexhaustedforfurtheractivity,thecellhasinsufficientenergyandtimetometabolize[A-]asacarbonsource,andtoalkalinizethepH.,①pH與微生物生長與發(fā)酵②pH與食品③pH抑菌/殺菌機(jī)理④pH動(dòng)態(tài)平衡與耐酸響應(yīng)細(xì)菌的pH動(dòng)態(tài)平衡質(zhì)子運(yùn)輸系統(tǒng)ATR系統(tǒng),按pH動(dòng)態(tài)平衡對細(xì)菌分類BacteriaclassifiedbypHhomeostasisTightcontrol如大腸桿菌，胞外pH變化1個(gè)單位，胞內(nèi)可能僅差0.1個(gè)單位。Lesstightlycontrol同步變化，但梯度比胞外小如果外部酸性增加，質(zhì)子流為凈進(jìn)入，則胞內(nèi)pH會(huì)改變，酶會(huì)變性，DNA會(huì)裂解。,胞內(nèi)pH的測定方法pH敏感電極法將微電極插入細(xì)胞內(nèi)(破壞細(xì)胞膜)核磁共振方法(31P和19F)不損傷細(xì)胞的完整性，可以連續(xù)的測定并且對一些重要的細(xì)胞反應(yīng)的pH進(jìn)行動(dòng)態(tài)追蹤，精度可達(dá)到0.06pH單位。(H2PO-4)的pKa(7.21)接近7，31P譜信號(hào)的化學(xué)位移隨環(huán)境pH的改變而變化,嗜酸菌和嗜堿菌嗜酸菌Acidophile保持胞內(nèi)pH6.0-6.5，有更大的△pH，對弱酸敏感。嗜堿菌Basophile可以pH11條件下生長，胞內(nèi)pH為7-9，表面蛋白在堿性條件下有活性。,④pH動(dòng)態(tài)平衡與耐酸響應(yīng)細(xì)菌的pH動(dòng)態(tài)平衡質(zhì)子運(yùn)輸系統(tǒng)ATR系統(tǒng),質(zhì)子泵和反向協(xié)同運(yùn)輸系統(tǒng)F-type質(zhì)子泵：是由許多亞基構(gòu)成的管狀結(jié)構(gòu)，H＋沿濃度梯度運(yùn)動(dòng)，所釋放的能量與ATP合成耦聯(lián)起來(ATP合酶)。F型質(zhì)子泵位于細(xì)菌質(zhì)膜，線粒體內(nèi)膜和葉綠體的類囊體膜上。不僅可以利用質(zhì)子動(dòng)力勢將ADP轉(zhuǎn)化成ATP，也可利用水解ATP釋放的能量轉(zhuǎn)移質(zhì)子。反向協(xié)同物質(zhì)跨膜運(yùn)動(dòng)的方向與離子轉(zhuǎn)移的方向相反，如動(dòng)物細(xì)胞常通過Na+/H+反向協(xié)同運(yùn)輸?shù)姆绞絹磙D(zhuǎn)運(yùn)H+以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH值，即Na+的進(jìn)入胞內(nèi)伴隨H+的排出。,膜運(yùn)輸?shù)鞍?lt;>Na+/H+葡萄糖/Na+,Structureofthec15ringoftheS.platensisATPsynthase.鈍頂螺旋藻naturestructural&molecularbiology,2009,16:1068-74theproton-coupledF1FoATPsynthase,Theringincludes15membrane-embeddedcsubunitsforminganhourglass-shapedassembly.Protontranslocationacrossthemembraneentailsprotonationofaconservedglutamatelocatednearthemembranecenterinthecsubunitouterhelix.F1:水溶性球蛋白,從內(nèi)膜突出于基質(zhì)中Fo:嵌合在內(nèi)膜上的疏水蛋白復(fù)合體，形成一個(gè)跨膜質(zhì)子通道。,Proposedmechanismofcoupledrotationandiontranslocationintheproton-dependentF-ATPsynthaseofS.platensisState0:Glu62處于質(zhì)子鎖定構(gòu)象State1:Glu62將質(zhì)子釋放，細(xì)胞質(zhì)pH8.3State2:去質(zhì)子的Glu62與帶正電的Arg形成鹽鍵，Glu62暫時(shí)穩(wěn)定于去質(zhì)子構(gòu)象。State3:從低pH區(qū)的另一個(gè)質(zhì)子競爭使Glu62重新質(zhì)子化，再進(jìn)入脂質(zhì)界面。therotormeetsthestator細(xì)胞質(zhì)親水環(huán)境疏水環(huán)境,④pH動(dòng)態(tài)平衡與耐酸響應(yīng)細(xì)菌的pH動(dòng)態(tài)平衡質(zhì)子運(yùn)輸系統(tǒng)ATR系統(tǒng),InduciblepHHomeostasisandtheAcidToleranceResponseofSalmonellatyphimuriumpHo7.7生長→pHo4.0快速死亡pHo5.8繁殖一代→pHo3.0存活,ATR系統(tǒng)結(jié)果：鼠傷寒沙門菌和大腸桿菌的酸耐受反應(yīng)在pH6.0-5.5時(shí)開始觸發(fā)，可以在pH3.0-4.0時(shí)保護(hù)細(xì)胞，而不能自我平衡適應(yīng)pH的細(xì)胞此時(shí)會(huì)死亡。ATR系統(tǒng)包括至少18個(gè)蛋白(2D-gel)。近來，fur基因產(chǎn)物(鐵吸收調(diào)節(jié)子)被認(rèn)為有重要的調(diào)節(jié)功能。,InduciblepHHomeostasisandtheAcidToleranceResponseofSalmonellatyphimuriumpH動(dòng)態(tài)平衡：環(huán)境pH在一個(gè)較寬的范圍內(nèi)變化，而體內(nèi)pH能保持相對穩(wěn)定。原因：質(zhì)子泵和鉀/質(zhì)子及鈉/質(zhì)子反向協(xié)同運(yùn)輸系統(tǒng)共存?？刂疲鹤儤?gòu)調(diào)節(jié)，存在蛋白合成的抑制劑。Nature409,413-416(18Jan.2001),pHi&celldeathEffectsofpHionthepHoofunadaptedcells5.8CelldeathoccurredatpH5.4andbelow2,4-二硝基苯酚無法合成細(xì)胞需要的ATP,使得細(xì)胞供能不足,細(xì)菌死亡是否與蛋白質(zhì)合成有關(guān)？ATR系統(tǒng)有一套預(yù)防或修復(fù)系統(tǒng)嗎？pHi是細(xì)胞死亡的直接原因嗎？,ProteinsynthesisisrequiredforATR-enhancedhomeostasis.ATRsurvivalbelowpHo4wasshowntorequiredenovoproteinsynthesisEitheranadditionalpHhomeostasissysteminducedduringadaptationoranewprotein(s)thatprotectspreexistinghomeostasismechanisms.,Correlationbetweenviabilityandthemeasurementofacid-damagedprotein.β-半乳糖苷酶可用來監(jiān)控pHi變化導(dǎo)致的蛋白損傷pH3.3,細(xì)菌死亡是否與蛋白質(zhì)合成有關(guān)？ATR系統(tǒng)有一套預(yù)防或修復(fù)系統(tǒng)嗎？pHi是細(xì)胞死亡的直接原因嗎？,DoestheATRsystemalsoprovidedmechanismsforrepairorpreventionofaciddamage?控制pHi預(yù)防或修復(fù)？？在pH5.8酸調(diào)節(jié)和未調(diào)節(jié)的沙門氏菌細(xì)胞調(diào)整到pHo5.1然后分別加入400uMDNP或33uMCCCP，用以平衡pHi和pHo。如果酸損傷可被酸調(diào)節(jié)細(xì)胞預(yù)防或修復(fù)，在質(zhì)子載體被去除后，酸調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活率應(yīng)比未調(diào)節(jié)細(xì)胞高。結(jié)果：pHi(5.3)和存活率均沒有區(qū)別。結(jié)論：在pH5.8酸調(diào)節(jié)沒有誘導(dǎo)出能修復(fù)酸損傷的內(nèi)部系統(tǒng)。休克前期的ATR系統(tǒng)主要是維持pHi進(jìn)而保持存活率。,細(xì)菌死亡是否與蛋白質(zhì)合成有關(guān)？ATR系統(tǒng)有一套預(yù)防或修復(fù)系統(tǒng)嗎？pHi是細(xì)胞死亡的直接原因嗎？,Screeningforspontaneousacid-tolerantmutants未經(jīng)酸調(diào)節(jié)細(xì)胞(JF1638orLT，2.2×108)調(diào)至pH3.3，至細(xì)胞存活數(shù)為100-1,000cell/ml。耐酸顯型中18%是營養(yǎng)缺陷型。其中44%需要谷氨酸，31%需要尿嘧啶，25%需要其他成分。需要谷氨酸的突變體(icd)缺乏異檸檬酸脫氫酶。另一突變體atr-12需要醋酸鹽才能獲得最快生長。異檸檬酸脫氫酶并非ATR的主要成分，因此它在酸調(diào)節(jié)時(shí)活性并不會(huì)發(fā)生改變。？？,pHiordamageacellsurfacecomponent(s)essentialforcellviabilityIcd突變體能積累大量的胞內(nèi)檸檬酸鹽和異檸檬酸鹽(40-50mM)。因?yàn)檫@種酸的pKi為6.4，有很強(qiáng)的緩沖能力使pHi趨向這一值，防止其降低到存活臨界點(diǎn)pH5.5。pHi--直接還是間接？是否有胞外物變性？增加內(nèi)部緩沖能力不能防止胞外的酸損傷,短桿菌肽A短桿菌肽A是一種形成通道的離子載體，它具有疏水的側(cè)鏈，兩個(gè)分子在一起形成跨膜的通道。它能夠有選擇地將單價(jià)陽離子順電化學(xué)梯度通過膜，可被該離子通道運(yùn)輸?shù)年栯x子有∶H+>NH4+>K+>Na+>Li+。,問題鼠傷寒沙門氏菌在酸性環(huán)境中pH的動(dòng)態(tài)平衡是依靠什么系統(tǒng)獲得的？這個(gè)系統(tǒng)有哪些重要的酶？鼠傷寒沙門氏菌在酸性環(huán)境中維持pH動(dòng)態(tài)平衡的機(jī)制有哪些？,2)水分活度水活度的概念aW=P/POP——一定溫度下基質(zhì)水分所產(chǎn)生的蒸汽壓Po——相同溫度下純水的蒸汽壓基質(zhì)水活度滲透壓水活度,微生物類群最低aW值范圍食品aW大多數(shù)細(xì)菌0.99-0.94鮮肉0.95-1.00嗜鹽性細(xì)菌0.75蛋0.97大多數(shù)酵母0.94-0.88火腿0.91耐滲透壓酵母菌0.66大多數(shù)霉菌0.94-0.73干制食品0.8-0.85喜旱真菌0.65奶粉0.20一般食品腐敗菌的生長最低aW在0.94-0.99最低aW值范圍與溫度、氧氣、pH及有害物質(zhì)的存在有關(guān)微生物生長的最低aW,滲透壓與微生物鹽對微生物的抑制機(jī)理嗜鹽微生物：特異性地需要Na+低等嗜鹽細(xì)菌(海洋菌，1-3%)、中等嗜鹽細(xì)菌(3-15%)、高度嗜鹽細(xì)菌(15-30%)耐鹽微生物耐糖微生物,微生物耐滲透壓原理在細(xì)胞體內(nèi)積累合適的溶質(zhì)(鹽、多元醇和AA)至一定的濃度，從而防止細(xì)胞脫水，甚至從環(huán)境中吸收水分。G-：Pro嗜鹽細(xì)菌：KCl耐鹽和耐旱真菌：甘油等多元醇單核細(xì)胞增生李斯特菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌：Gly和甜菜堿,SaltStressProteinsInducedinListeriamonocytogenes存活的環(huán)境很廣：滲透壓：10%NaClT：0.1–45℃pH：在pH5.5調(diào)節(jié)后可低至3.5經(jīng)常從高鹽制品中分離得到，如煙薰鮭魚。甚至在22℃放置150天的純鹽中還能檢測出來。,SaltStressProteinsInducedinListeriamonocytogenes當(dāng)細(xì)菌生存的環(huán)境中，一些影響生長或存活的參數(shù)發(fā)生改變后，會(huì)啟動(dòng)新的基因表達(dá)程序，一些蛋白會(huì)增加或降低表達(dá)以應(yīng)對環(huán)境壓力。用2-DPAGE檢測鹽壓力下蛋白的表達(dá)。在鹽壓力下有40個(gè)蛋白/400-500個(gè)的表達(dá)被明顯誘導(dǎo)或抑制。其中一些蛋白用MS或N-末端序列分析和數(shù)據(jù)庫搜索的方法進(jìn)行鑒定。12個(gè)高誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白與普通的應(yīng)力蛋白(Ctc和DnaK)、轉(zhuǎn)運(yùn)子(GbuA和甘露糖特異的磷酸轉(zhuǎn)移酶IIAB)和普通的代謝蛋白(丙氨酸脫氫酶等)相似。APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,2002,68(4):1491–1498,3)氧化還原電位(Eh)當(dāng)電子從一個(gè)化合物轉(zhuǎn)移到另一個(gè)化合物時(shí)，兩物質(zhì)間就產(chǎn)生電勢差。物質(zhì)被氧化得越多，Eh越高，當(dāng)氧化物和還原物濃度相等時(shí)，電勢為零。分子態(tài)氧影響基質(zhì)的氧化還原狀態(tài)。好氧微生物需要正的Eh(被氧化)，其生長繁殖能降低環(huán)境中的Eh。食品中有利于維持還原條件的物質(zhì)：肉中SH基、VC，果蔬中的還原糖等。,食品的Eh和微生物繁殖+820mV-420mV+436mV+409mV+383mV+220～+340mV梨汁葡萄汁檸檬汁奶生碎肉+225mV荷蘭干酪-20～-310mV僵硬后肌肉-150mV整粒小麥-320～-360mV+100mV好氧微生物+300～+400mV厭氧微生物兼性厭氧微生物有氧呼吸兼性厭氧微生物無氧呼吸,4)營養(yǎng)成分微生物生長需要的營養(yǎng)物質(zhì)：水、能源、氮源、維生素及相關(guān)的生長因子、礦物質(zhì)微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的利用簡單化合物（AA、單糖等）、大分子（多肽、簡單多糖等）、復(fù)雜化合物（蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素、油脂）蛋白質(zhì)（變性）蛋白酶胞外短肽肽酶胞內(nèi)AA脫氨脫羧有機(jī)酸、吲哚、胺H2S、NH3等先簡單，后復(fù)雜（二次生長現(xiàn)象）,二次生長現(xiàn)象,蛋白質(zhì)脂肪單糖或雙糖有機(jī)酸和醇類淀粉、(半)纖維素細(xì)菌大多數(shù)大多數(shù)絕大多數(shù)部分少數(shù)酵母較弱少數(shù)絕大多數(shù)大多數(shù)極少數(shù)真菌大多數(shù)，且多強(qiáng)于細(xì)菌大多數(shù)大多數(shù)少數(shù)極少數(shù)微生物的分解能力,5)抗微生物成分具有抗微生物成分的食品，有較強(qiáng)的抗菌能力部分食品含有具抗菌能力的油雞蛋、牛乳中的溶菌酶乳免疫球蛋白IgG（牛）、IgA（人）、IgD、IgE、IgM）乳過氧化物酶/SCN-/H2O2體系抑制期→乳鏈球菌期→乳酸桿菌期→真菌期→胨化菌期外源性的抗微生物成分生物殺菌劑、化學(xué)殺菌劑,6)生物結(jié)構(gòu)天然食品自身的外層結(jié)構(gòu)種子的種皮水果的外皮堅(jiān)果的殼動(dòng)物的皮毛蛋殼加工食品的外包裝有類似作用腸衣、包裝袋、瓶罐