第六節(jié)食源性病原微生物致病機(jī)理1、食源性致病菌與食源性疾病2、細(xì)菌的致病性和毒力3、宿主的防御機(jī)理4、Stepsinsuccessfulinfection,5.Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TypeⅢsecretionsystem,T3SS)細(xì)菌的分泌系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)是近年為細(xì)菌致病機(jī)制研究的重要進(jìn)展，其中的Ⅲ型分泌系統(tǒng)與動植物的許多革蘭氏陰性病原菌的毒力因子的分泌有關(guān)。在病原菌與宿主細(xì)胞接觸后，這一系統(tǒng)得以啟動，具有接觸介導(dǎo)的特征。啟動后細(xì)菌分泌與毒力有關(guān)的多種蛋白質(zhì)，與相應(yīng)的伴侶蛋白結(jié)合，從細(xì)菌的胞漿直接進(jìn)入宿主細(xì)胞胞漿，發(fā)揮毒性作用。,幾個細(xì)菌的毒力島及其特征,Ⅲ型分泌系統(tǒng)的組成與分泌機(jī)制Ⅲ型分泌系統(tǒng)的組成通常由30～40kbp大小的基因組編碼，以毒力島的形式存在于細(xì)菌的大質(zhì)?；蛉旧w。有許多高度保守的主要結(jié)構(gòu)成分，有20種以上的蛋白質(zhì)組成，在分泌中不同蛋白質(zhì)發(fā)揮各自的功能型系統(tǒng)。Ⅲ型分泌系統(tǒng)的分泌機(jī)制是一次性分泌，是信號肽不依賴型的。可分泌幾種效應(yīng)蛋白，蛋白質(zhì)直接從胞漿送達(dá)細(xì)胞表面。該系統(tǒng)通常在與宿主細(xì)胞接觸后啟動，且分泌產(chǎn)物能夠注入細(xì)胞，從而影響宿主細(xì)胞信號活動，以利于細(xì)菌的入侵。,Ⅲ型分泌系統(tǒng)與細(xì)菌致病性的關(guān)系其關(guān)鍵作用是通過接觸依賴性轉(zhuǎn)運將底物蛋白轉(zhuǎn)運到真核細(xì)胞內(nèi)。缺失了該系統(tǒng)的鼠傷寒沙門菌，不論感染途徑如何，都不引起全身性疾病。,Ⅲ型分泌系統(tǒng)的特點是一種多成分分泌系統(tǒng)，在G-細(xì)菌中高度保守。關(guān)鍵作用是通過接觸依依賴性轉(zhuǎn)運將底物蛋白轉(zhuǎn)運到真核細(xì)胞內(nèi)。其分泌的蛋白質(zhì)不具有典型的分泌蛋白分泌依賴的sec模式。分泌需要輔助蛋白。分泌蛋白質(zhì)通過細(xì)菌內(nèi)外兩層膜轉(zhuǎn)運到真核細(xì)胞內(nèi)。能夠把效應(yīng)分子直接從胞質(zhì)輸送到細(xì)胞表面。溫度，鹽分等環(huán)境因素，可誘導(dǎo)分泌裝置和效應(yīng)分子的合成。許多編碼該系統(tǒng)的基因與細(xì)菌鞭毛裝置基因有一定的同源性。編碼該系統(tǒng)的基因通常聚在一起DNA片段較大。,ProteindeliveryintoeukaryoticcellsbytypeIIIsecretionmachines.Vol444,2006,Nature,TypeIIIsecretionmachines與真核宿主長期共存的細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化形成了特殊的適應(yīng)能力，從而在這種環(huán)境中生存和復(fù)制。這些適應(yīng)中最明顯的就是III型分泌系統(tǒng)--一種特別進(jìn)化形成的可將細(xì)菌蛋白輸入真核細(xì)胞的細(xì)胞器官。盡管最早是在少數(shù)病原菌中被發(fā)現(xiàn)，實際上T3SSs可被許多細(xì)菌編碼。不僅是細(xì)胞器官的組裝和蛋白的分泌，而且還存在合作關(guān)系，且與致病機(jī)理有關(guān)。,Theassemblyofaprotein-deliverymachine針狀組合體由20多種蛋白組成，是迄今發(fā)現(xiàn)的最復(fù)雜的細(xì)菌蛋白分泌系統(tǒng)。該組合體最早在鼠傷寒沙門菌中發(fā)現(xiàn)，后來在多種其他細(xì)菌中檢測到，被認(rèn)為是所有T3SSs的核心成分。,針狀組合體組裝過程模型discretesteps不連續(xù)的步驟,Multiplesignalstoensuresubstratespecificity轉(zhuǎn)位酶,革蘭氏陰性菌蛋白分泌系統(tǒng)T1SS分泌系統(tǒng)，又稱ABC分泌系統(tǒng)由位于內(nèi)膜的提供蛋白質(zhì)分泌能量的ABC轉(zhuǎn)位酶、定位在內(nèi)膜跨過周質(zhì)的膜融合蛋白(MFP)和外膜蛋白(OMP)等3種功能蛋白組成。大腸桿菌A-溶血素分泌系統(tǒng)該系統(tǒng)所分泌的蛋白直接從胞質(zhì)到達(dá)細(xì)菌表面,僅有HlyB、HlyD、TolC三種蛋白參與。其中HlyB、HlyD是位于內(nèi)膜上的特異組成成分,TolC是位于外膜上形成通用孔道的多系統(tǒng)通用成分。,T2SS廣泛存在于G-菌中,向細(xì)胞外分泌各種蛋白，包括胞外酶、蛋白酶、毒素和毒性因子，這些胞外蛋白毒性因子通常破壞寄主細(xì)胞，引起組織壞死和病害。分泌元件主要包括:一系列的內(nèi)膜蛋白(SecD、SecF和SecY),一個為跨膜提供能量的胞內(nèi)附膜蛋白ATPase(SecA),一個和分泌蛋白相結(jié)合的分子伴侶(SecB),以及周質(zhì)中的信號肽切除酶。,T4SS是接觸依賴性分泌系統(tǒng)，該系統(tǒng)轉(zhuǎn)運的都是一些大分子物質(zhì),如核蛋白顆粒、含多個亞單位的毒素等。該分泌系統(tǒng)是一種自主運輸系統(tǒng)，其分泌的蛋白需切割、加工，而后形成一個孔道使自身穿出外膜。,T5SS系統(tǒng)所分泌的蛋白質(zhì)首先通過Sec依賴的分泌通路跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運，到達(dá)外周質(zhì)間隙后，通過自身C端β結(jié)構(gòu)域在外膜上形成一個β折疊桶，從而實現(xiàn)跨外膜轉(zhuǎn)運。原蛋白可以從β折疊桶結(jié)構(gòu)域上切割下來或者仍與其相連。自主轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng),第七節(jié)食源性微生物風(fēng)險評估,我國食品安全風(fēng)險評估現(xiàn)狀2009-12-8成立第一屆國家食品安全風(fēng)險評估專家委員會食品安全風(fēng)險評估管理規(guī)定（試行）2010-1-212010-4-22北京，“2010年國際食品安全論壇”，衛(wèi)生部食品安全綜合協(xié)調(diào)與衛(wèi)生監(jiān)督局局長蘇志：中國擬建食品安全風(fēng)險評估中心。,風(fēng)險評估風(fēng)險評估是WTO和CAC(國際食品法典委員會)強調(diào)的用于制定食品安全控制措施的必要技術(shù)手段，是政府制定食品安全法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)和政策的主要基礎(chǔ)，也是實施危險管理措施(如HACCP)的主要依據(jù)。WTO的動植物檢疫協(xié)議(SPS協(xié)議)規(guī)定在確定各國適當(dāng)?shù)男l(wèi)生和植物衛(wèi)生措施的保護(hù)水平時應(yīng)以危險性評估的結(jié)果為主要依據(jù)，即必須在風(fēng)險評估的基礎(chǔ)上，制定食品中污染物的限量標(biāo)準(zhǔn)。,食源性微生物安全管理制度TheInternationalCommissiononMicrobiologicalSpecificationsforFoods,ICMSF,微生物風(fēng)險評估的原理風(fēng)險評估是食品風(fēng)險分析(包括風(fēng)險評估、風(fēng)險管理和風(fēng)險信息交流)的基礎(chǔ)和核心。四個階段:危害識別：定性方法危害描述：定性/定量方法暴露評估：定性/定量方法風(fēng)險描述：定性/定量方法英國型或一體型，法國型或分離型,微生物風(fēng)險評估的評估方法定性風(fēng)險評估根據(jù)風(fēng)險的大小，人為地將風(fēng)險分為低風(fēng)險、中風(fēng)險、高風(fēng)險等類別，以衡量危害對人類影響的大小。定量風(fēng)險評估對風(fēng)險的性質(zhì)和嚴(yán)重程度的評估，根據(jù)危害的毒理學(xué)特征或感染性、中毒性作用特征，結(jié)合其它相關(guān)資料，確定污染物(或危害物)的攝入量及其對人體產(chǎn)生不良作用的概率，并對它們之間的關(guān)系進(jìn)行數(shù)學(xué)描述。預(yù)測微生物學(xué)和數(shù)學(xué)模型,風(fēng)險評估的關(guān)鍵在于收集充分的高質(zhì)量可用信息(如因攝入被污染食品引發(fā)疾病的真實資料、數(shù)據(jù),爆發(fā)數(shù)據(jù)和相關(guān)流行病學(xué)資料，消費者消費方式方面的資料等)，必須達(dá)到權(quán)威機(jī)構(gòu)如WHO、CAC、美國環(huán)境保護(hù)局(EPA)、FDA、經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)等所認(rèn)可的最基本數(shù)據(jù)量，其結(jié)果才有意義。,JEMRA對即食食品中的單增的風(fēng)險評估在食品中微生物的數(shù)目從25克無致病菌到每克或每毫升含有1000菌落形成單位(ColonyFormingUnits,CFU)范圍內(nèi)，評估食品中單增導(dǎo)致疾病的嚴(yán)重風(fēng)險;評估不同易感人群相對于普通群體患嚴(yán)重疾病的風(fēng)險;評估特定食品中單增導(dǎo)致嚴(yán)重疾病的風(fēng)險。theJointFAO/WHOExpertMeetingsonMicrobiologicalRiskAssessment,1.危害識別指識別可能產(chǎn)生健康不良效果并且可能存在于某種或某類食品中的生物、化學(xué)和物理因素。對于微生物因素：識別食品中的微生物有機(jī)體或微生物毒素及其與人體健康危害的關(guān)系。分析類型應(yīng)包括傳染率(無明顯病狀)、發(fā)病率和死亡率。,危害識別的內(nèi)容①微生物的基本性狀;②作為危害暴露結(jié)果的由微生物所致的食源性疾病的資料;③疾病的易感人群以及傳播方式;④暴發(fā)數(shù)據(jù)和相關(guān)流行病學(xué)資料;⑤與食品相關(guān)的資料：簡要描述何種食品中可存在此微生物，典型危害水平。,RiskassessmentofListeriamonocytogenesinready-to-eatfoods.Website:http://www.fao.org/es/esnAustralianRiskAssessmentmodelforListeriamonocytogenesinready-to-eatmeatshttp://www.foodrisk.org/exclusives/models/AU_listeria.cfm,HazardidentificationIdentifiesknownorpotentialhealtheffectsassociatedwithL.monocytogenesbyestablishingthegeneralrelationshipbetweenthepathogen,itspresenceinfoods,andtheadverseoutcome(illnessordeath)associatedwithconsumptionofcontaminatedfoods.,PopulationGroupsEvaluatedPerinatal:Theperinatalgroupincludesfetusesandneonatesfrom16weeksafterfertilizationto30dayspostpartum.Elderly:Individualswhowere60ormoreyearsofage.Intermediate-agegroup:bothhealthyindividualsandcertainsusceptiblesubpopulationgroups,suchasAIDSpatientsorindividualstakingdrugsthatsuppresstheimmunesystems).在歐盟，55.6%的李斯特菌病患者大于65歲。以前，感染此病的人大多是孕婦，但現(xiàn)在主要是傳染老年人中免疫力低下的人群。在美國，88%患病與懷孕無關(guān)，71%的患者年齡大于44歲，40%的患者年齡大于或等于70歲。,危害識別單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌屬7個種中的1個,該菌為G+、兼性厭氧菌,可以在Aw>0.92、pH值4.39～9.4、溫度-0.4～45℃、鹽濃度≤10%的環(huán)境下生長.分布廣泛，人和動物糞便中均可能存在該菌。人和多種動物均可是該菌的健康攜帶者，估計2%～6%的人和動物攜帶有該菌，因此人或動物糞便污染食物后經(jīng)口傳播是該菌的主要傳播途徑。但李斯特菌病的暴發(fā)和散發(fā)病例主要與即食食品有關(guān)。李斯特氏病的發(fā)病率為每年每百萬人2～6例，死亡率20%～30%。,危害識別70℃以上的熱處理可以殺滅單增李斯特氏菌。在煮制與包裝工序間可能會發(fā)生二次污染，在較長時間(如≥35d)的貯藏期內(nèi)，該菌可在產(chǎn)品表面繁殖,數(shù)量增加至產(chǎn)生危害的水平。美國人患李斯特菌病主要是散發(fā)（僅5%的病例與疾病暴發(fā)有關(guān)）。人類李斯特菌病散發(fā)及暴發(fā)流行病例均表明污染LM的即食食品與運輸有關(guān)。,危害識別據(jù)美國CDC報道，美國每年約有2,500例李斯特菌病例,其中約有20%死亡。1999年，單增引起的致死率在所有食源性致病菌中位居第二位，引起的住院率位居第一位(90%)。在23個歐盟成員國中，2001年有910人患李斯特菌病，2005年1427例，2006年為1583例,是1996年病例數(shù)的2.4倍,發(fā)病率為0.3/100萬,其致死率超過30%，住院率高達(dá)91%。澳大利亞:2006年李斯特菌病為59例,發(fā)病率為3/100萬,與2001-2005年的平均發(fā)病率(3.2/100萬)相似。日本：每年的病例數(shù)為83例,發(fā)病率為0.65/100萬,,2.危害描述對與食品中可能存在的生物、化學(xué)和物理因素有關(guān)的健康不良效果性質(zhì)的定性或定量評價。對生物或物理因素,如數(shù)據(jù)可得到時，應(yīng)進(jìn)行劑量-反應(yīng)評估。劑量-反應(yīng)評估的目的是確定某種化學(xué)、生物或物理因素的暴露水平(劑量)與相應(yīng)的健康不良效果的嚴(yán)重程度或發(fā)生頻度(反應(yīng))之間的關(guān)系。Estimatestherelationshipbetweentheexposurelevel(dose)andfrequencyofsevereillnessormortality(response).,危害特征描述的內(nèi)容致病菌的致病性、毒力、傳染性、抗生素耐藥性;相關(guān)食品對致病菌生長、增殖、產(chǎn)毒和感染力的影響;宿主和媒介生物的特性;致病菌造成的疾病和并發(fā)癥，致病菌引起的免疫反應(yīng);劑量-反應(yīng)關(guān)系模型(指數(shù)模型、β-泊松模型、韋伯-伽馬模型、蒙特卡羅模型)的構(gòu)建等。,危害描述WHO李斯特氏病其列為1990’s四大食源性致病菌之一；孕婦、嬰兒、60歲以上老人和免疫低下的人是易感人群；李斯特氏病輕度癥狀表現(xiàn)為流感癥狀，中度表現(xiàn)為胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等，嚴(yán)重的可致死，死亡率可達(dá)20%～30%。,危害描述食源性李斯特氏病的發(fā)生：偶然的孤立事件：如家庭冰箱的二次污染造成。局部發(fā)生：由于加工廠操作不當(dāng)造成某一批產(chǎn)品殘存單增李斯特氏菌，且該批產(chǎn)品在食用前有機(jī)會生長繁殖,消費者食用該產(chǎn)品后得病。大面積發(fā)生：由于加工設(shè)備或環(huán)境污染了單增李斯特氏菌，造成該車間或生產(chǎn)線生產(chǎn)的多批產(chǎn)品污染該菌，消費者食用該產(chǎn)品后得病。,劑量反應(yīng)關(guān)系P=1-e-r*N。P表示嚴(yán)重疾病(侵染性李斯特菌病)的概率N代表攝入單增的數(shù)量r代表單一細(xì)菌導(dǎo)致侵襲性李斯特菌病的概率，是根據(jù)美國2001年暴露模型中的食品污染分布以及CDC對李斯特菌病估計病例數(shù)倒推而得到的。,HumanSusceptibilityImmunologicalandphysiologicalfactorsinhumansplayaroleindeterminingthesusceptibilitythatmaybefoundthroughoutapopulation.Theprobabilityofdeathisdescribedforthethreedifferentage-basedgroupsofpeople.Asindicatedabove,epidemiologicalinformationisusedtoadjustthedose-responsemodeltofitthenumberoflisteriosisfatalitiesobservedinFoodNetandtodevelopthedose-responsemodelforeachofthesegroups.,VirulenceEpidemiologicalinformationandlaboratorystudiesindicatethatdifferentstrainsofL.monocytogenesvaryintheirabilitytocauseillness.Thisvariabilityinfluencesthenumberoforganismsrequiredtoproduceillnessandpossiblytheseverityofsymptomsofillness.Alargenumberofpotentialhumanvirulencefactorshavebeendescribedthatseemtooccurinessentiallyallofthehumanandenvironmentalisolatesthathavebeenstudied.Datafrommouselethalitystudiesareusedtomodeltherangeofstrainvirulencethatmaybeencountered.,3.暴露評估指對于通過食品的可能攝入和其他有關(guān)途徑暴露的生物、化學(xué)和物理因素的定性或定量評價。微生物因素：對所消費食品中的致病菌的數(shù)量或細(xì)菌毒素含量以及有關(guān)的膳食信息進(jìn)行評估,給出食品在食用時致病菌的數(shù)量或細(xì)菌毒素含量的估計值。其污染水平是動態(tài)變化的,所以暴露評估應(yīng)描述從生產(chǎn)到消費的整個過程。預(yù)測微生物學(xué)是暴露量評估的有用工具。,暴露評估很多種食品都曾導(dǎo)致過零星發(fā)生或大規(guī)模爆發(fā)的食源性李斯特氏病,在這些食品中單增李斯特氏菌的含量約為100～1×109cfu/g;其中即食食品最容易污染。SCVPH在1999年報道動物食品中李斯特菌病發(fā)生率是1%～10%。這與其在2005及2006年的報道一致大量分子分型實驗已證實食品生產(chǎn)廠的環(huán)境是食品污染LM的污染源；溫度是影響食品中LM的重要因素之一,FoodConsumptionFoodContaminationPost-RetailGrowthofListeria--“growthmodule”.考慮消費前致病菌生長繁殖的影響因素,如:貯藏溫度、貯藏時間、在不同食品中的生長速度(采用預(yù)測性模型評估在食品中的生長速度、失活速度及生長限制)等;結(jié)合食品消費的數(shù)量和頻率,將各種因素擬和到模型中,從而獲得消費時食品中單增的濃度,以log10CFU/份污染食品的累積概率來表示。,,歐盟2005年LM污染率較高的即食食品是肉（2.7%）及魚制品（7.5%），其中魚制品中29%的污染量大于100/g。2006年LM污染最高的即食食品是魚制品（4.9%），其次是牛肉制品（3.5%）和豬肉制品（2.7%）。少量樣品的污染量高于100/g。歐盟委員會2004年和2005年的概要報道中，2%～3%的零售即食蔬菜含有LM，低于1%的樣品中含有高于100cfu/g的LM；0.4%的奶油樣品被LM污染。,4.風(fēng)險描述根據(jù)危害識別、危害描述和暴露評估，對某一給定人群的已知或潛在健康不良效果的發(fā)生可能性和嚴(yán)重程度進(jìn)行定性或定量的估計，包括與這些評估有關(guān)的不確定性的描述。將前面階段的所有信息結(jié)合在一起，提供一個給定人群的合理評價。這種評估可以通過將單個與危害有關(guān)的流行病學(xué)數(shù)據(jù)與疾病的普遍性進(jìn)行比較而得到。,風(fēng)險特征描述必須回答:影響健康的風(fēng)險的本質(zhì)及發(fā)生的可能性;哪些個體或人群存在上述風(fēng)險;不良效應(yīng)或影響的嚴(yán)重程度。,,‘What-If’Scenarios假設(shè)分析方法RefrigeratorTemperatureScenarioStorageTimesScenarioHomerefrigeratorstemperaturesCasesoflisteriosisThepredictednumberreducednormal210545ºForless65669%notexceed41ºF28>98%StoragetimeCasesoflisteriosisThepredictednumberreduced28days22814days19713.6%10days15432.5%,風(fēng)險描述綜合了前3個步驟的資料信息，將暴露評估的結(jié)果應(yīng)用于劑量-反應(yīng)關(guān)系模型，最后用不同人群每百萬份食品產(chǎn)生的風(fēng)險來表示結(jié)果，并用每份食品的風(fēng)險、食品份數(shù)來估計特定群體中每年的病例數(shù)。評估結(jié)果顯示，對于消毒牛奶、冰淇淋、發(fā)酵肉類和熏魚，每年每千萬人中李斯特菌病病例數(shù)分別為9.1、0.012、0.46和0.00066。,其他一些重要結(jié)果幾乎所有李斯特菌病均因食用了大量病原菌所致。因攝入單增菌致病的概率可以用致病三要素(食品成分、菌種致病力、消費者易感性)來解釋。絕大多數(shù)的李斯特菌病與食用不符合現(xiàn)行食品限量標(biāo)準(zhǔn)的食品有關(guān)，而與標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)格程度(0.04CFU/g或100CFU/g)無關(guān)。防止食品食用時出現(xiàn)重度污染的控制措施,對降低李斯特菌病發(fā)病率具有極大作用。對于有利于病原菌生長的食物,更嚴(yán)格地控制溫度或限制貯存時間等控制措施,將會減輕因單核細(xì)胞增生李斯特菌數(shù)量的增加而導(dǎo)致的風(fēng)險的增加。,QuantitativeMicrobialRiskAssessmentforStaphylococcusaureusandStaphylococcusEnterotoxinAinRawMilkJournalofFoodProtection,72(8)2009,1641–1653,國內(nèi)的相關(guān)研究對牡蠣副溶血弧菌的風(fēng)險評估對帶殼雞蛋中的沙門菌的定量風(fēng)險評估對進(jìn)境凍大馬哈魚溶藻弧菌的風(fēng)險評估等,存在問題數(shù)據(jù)不連續(xù)數(shù)據(jù)覆蓋的地區(qū)少等